УДК 579.62; 579.64
DOI: 10.36871/vet.zoo.bio.202601209

Авторы

Андрей Сергеевич Пырсиков,
Дмитрий Алексеевич Макаров,
Ольга Евгеньевна Иванова,
Дмитрий Алексеевич Блюменкранц,
Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), Москва, Россия
Сеидфатима Мировна Борунова,
Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), Москва, Россия; Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К. И. Скрябина, Москва, Россия

Аннотация

Антибиотикорезистентность (АМР) остаётся одной из ключевых глобальных угроз, затрагивающих медицинский и ветеринарный секторы, что диктует требования к внедрению стандартизированных методов мониторинга. В условиях отсутствия на рынке специализированных диагностических систем для ветеринарных специалистов особую актуальность приобретает разработка микропланшетов с лиофилизированными антибиотиками, предназначенных для проведения ветеринарного мониторинга АМР зоонозных и индикаторных бактерий. В статье приведен обзор литературных данных о методологических аспектах разработки таких микропланшетов, включая определение перечня микроорганизмов, антибактериальных препаратов и их концентраций, подбор стабилизирующих композиций, оптимизацию режимов низкообъёмной лиофилизации и определение её критических термодинамических параметров, факторов риска, связанных с замораживанием, сушкой и хранением. Отдельное внимание уделено выбору упаковочных решений, а также методам контроля сохранности антибиотиков, от микробиологических тестов до высокоточных ВЭЖХ-МС методов. Обобщение литературных и технологических данных подтверждает, что разработка таких микропланшетов является технически осуществимой и критически важной для повышения точности и сопоставимости данных в национальных системах мониторинга АМР и их гармонизации с международными программами надзора.

Ключевые слова

антибиотикорезистентность, зоонозные бактерии, антибиотик, микропланшеты, лиофилизация

Список литературы

  1. Выделение и идентификация бактерий вида Тrueperella abortisuis из нативного семени хряков-производителей / П. Н. Абрамов, С. Н. Барзыкина, С. М. Борунова [и др.] // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2024. Т. 2, № 11. С. 46–60. – DOI 10.36871/ vet.zoo.bio.202411205. – EDN ICAKRQ.
  2. Количественный и видовой состав бактерий семейства Enterobacteriaceae в содержимом тонкого и толстого кишечника сельскохозяйственных птиц и идентификация бактерии вида E. albertii / В. В. Пономарев, С. М. Борунова // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2025. № 9. С. 77–97. – DOI 10.36871/vet. zoo.bio.202509109. – EDN PUNNGN.
  3. Методы определения чувствительности зоонозных бактерий к антибиотикам / Д. А. Макаров, А. С. Пырсиков, О. Е. Иванова [и др.] // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2025. № 2. С. 107–122. – DOI 10.36871/vet.zoo.bio.202502112. – EDN KERQJR.
  4. Яцентюк С. П. Проблема контаминации спермы быковпроизводителей инфекционными агентами бактериальной и вирусной природы / С. П. Яцентюк, С. М. Борунова, Т. Н. Грязнева // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2021. № 9. С. 26–30. – DOI 10.36871/vet.zoo. bio.202109003. – EDN GMERCS.
  5. Smith J., Brown L., Wilson R. Development of veterinary antimicrobial susceptibility testing: current status and challenges // Veterinary Microbiology. 2021. Vol. 258. P. 109125
  6. Макаров Д. А., Иванова О. Е., Пырсиков А. С. и др. Методы определения чувствительности зоонозных бактерий к антибиотикам// Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2025. №2. С. 107–112.
  7. Jones P., Miller A. Antimicrobial susceptibility testing in livestock: limitations of current approaches // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2020. Vol. 32(6). Pр. 885–893.
  8. Khan M., Liu H., Zhang Y. Pharmacokinetic variability of antibiotics in food-producing animals: implications for susceptibility testing // Frontiers in Veterinary Science. 2022. Vol.
  9. Article 879345. 9. Garcia P., López M. Antimicrobials in cattle production: therapeutic ranges, resistance patterns and diagnostic gaps // Animal Health Research Reviews. 2019. Vol. 20(2). Pр. 167–178.
  10. CLSI VET01S Ed7 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals.
  11. Integrated Surveillance of Antimicrobial Resistance in Foodborne Bacteria: Application of a One Health Approach. Geneva: World Health Organization; 2017. Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO.
  12. World Organisation for Animal Health. Terrestrial animal health code.
  13. FAO. 2019. Monitoring and surveillance of antimicrobial resistance in bacteria from healthy food animals intended for consumption. Regional Antimicrobial Resistance Monitoring and Surveillance Guidelines – Vol. 1. Bangkok.
  14. Antimicrobial wild type distributions of microorganisms EUCAST https://mic.eucast. org/search (дата обращения 15.10.2025).
  15. Российские рекомендации. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Версия 2024- 02. Год утверждения (частота пересмотра): 2024 (пересмотр ежегодно). – МАКМАХ, СГМУ: Смоленск, 2024. 192 с.
  16. Clinical Breakpoints EUCAST. URL: https://www.eucast.org/clinical_breakpoints. (дата обращения 11.10.2025).
  17. Free Microbiology Resources. URL: https:// clsi.org/standards/products/free-resources/ access-ourfree-resources. (дата обращения 11.10.2025).
  18. AMRmap online platform https://amrmap. ru/ (дата обращения 01.09.2024).
  19. Kahlmeter G. Wild-type MIC distributions and epidemiological cut-off values: relevance for resistance surveillance and breakpoint setting // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2023. Vol. 78(5). Pр. 1151–1160.
  20. Feßler A. T., Kadlec K., Schwarz S. Antimicrobial susceptibility testing in veterinary medicine // One Health Advances. 2023. Vol. 1. Article 4.
  21. EARS-Vet network. A European Antimicrobial Resistance Surveillance network in veterinary medicine (EARS-Vet) – objectives and methodological framework // EU-JAMRAI, 2022. URL: (дата обращения: 27.11.2025.
  22. Arakawa T., Kita Y., Carpenter J. F. Protein–solvent interactions in pharmaceutical formulations //Pharmaceutical research. 1991. Vol. 8. №. 3. Рр. 285–291.
  23. Arakawa T. et al. Factors affecting shortterm and long-term stabilities of proteins // Advanced Drug Delivery Reviews. 1993. Vol. 10. №. 1. Рр. 1–28.
  24. Pikal M. J. Freeze-drying of proteins. Part II: Formulation selection //BioPharm. 1990. Vol. 3. №. 9. Рр. 26–30.
  25. Greaves R. I. N., The Preservation of Proteins by Drying With Special Reference to the Production of Dried Human Serum and Plasma for Transfusion. 1946, Medical Research Council (HMSO): London.
  26. Bell L. N. Peptide stability in solids and solutions //Biotechnology progress. 1997. Vol. 13. №. 4. Рр. 342–346.
  27. Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals // International journal of pharmaceutics. 1999. Vol. 185. №. 2. Рр. 129–188.
  28. Maa Y. F. et al. Protein inhalation powders: spray drying vs spray freeze drying //Pharmaceutical research. 1999. Vol. 16. №. 2. Рр. 249–254.
  29. Pikal M. J. The Impact of the Freezing Stage in Lyophilization: Effects of the Ice Nucleation Temperature on Process Design and Product Quality / M. J. Pikal, S. Rambhatla, R. Ramot // American Pharmaceutical Review. 2002. Vol. 5. Рр. 48–53.
  30. Tang X. Design of Freeze-Drying Processes for Pharmaceuticals: Practical Advice / X. Tang, M. Pikal // Pharmaceutical Research. 2004. Vol. 21. Рр. 191–200.
  31. Гусаров Д. А. Лиофилизация биофармацевтических белков (миниобзор) / Д. А. Гусаров // Биофармацевтический журнал. 2010. Т. 2(5). С. 3–7.
  32. Franks F. Freeze-Drying of Pharmaceuticals and Biopharmaceuticals / F. Franks, T. Auffret – Cambridge, UK: RSCPublishing, 2007. 220 р.
  33. Searles J. A., Carpenter J. F., Randolph T. W. The ice nucleation temperature determines the primary drying rate of lyophilization for samples frozen on a temperature-controlled shelf //Journal of pharmaceutical sciences. 2001. Т. 90. №. 7. Рр. 860–871.
  34. Cochran T. Ice nucleation temperature influences recovery of activity of a model protein after freeze drying / T. Cochran, S. L. Nail // Journal of Pharmaceutical Sci-ences. 2009. Vol. 98. Рр. 3495–3498.
  35. Heller M. C. Protein formulation and lyophilization cycle design: prevention of damage due to freezeconcentration induced phase separation / M.C. Heller, J.F. Carpenter, T.W. Randolph // Biotechnology and Bioengineering. 1999. Vol. 63. Рр.166–174.
  36. Грачева И. В. Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протективное действие защитных сред / И. В. Грачева, А. В. Осин // Проблемы особо опасных инфекций. 2016. Вып. 3. С. 5–12. № 4(12). С. 99–118
  37. Constantino H. R. Lyophilization of Biopharmaceuticals / H. R. Constantino, M. J. Pikal Arlington, VA, USA: AAPS Press, 2004. 686 p.
  38. Нежута А. А. Научное обоснование и методика разработки и совершенствования промышленной технологии сублимационного высушивания биопрепаратов: 03.00.23: дис. д-ра биол. наук / Нежута Александр Александрович. Щелково, 2003. 243 с.
  39. Bhatnagar B. S., Pikal M. J., Bogner R. H. Study of the individual contributions of ice formation and freeze-concentration on isothermal stability of lactate dehydrogenase during freezing //Journal of pharmaceutical sciences. 2008. Vol. 97. №. 2. Рр. 798–814.
  40. Colandene J. D. et al. Lyophilization cycle development for a high-concentration monoclonal antibody formulation lacking a crystalline bulking agent //Journal of pharmaceutical sciences. 2007. Vol. 96. №. 6. Рр. 1598–1608.
  41. Luthra S. Impact of critical process and formulation parameters affecting in-process stability of lactate dehydrogenase during the secondary drying stage of lyophiliza-tion: A mini freeze dryer study / S. Luthra, J.-P. Obert, D. S. Kalonia, M. J. Pikal // Journal of Pharmaceutical Sciences. 2007. Vol. 96. Рр. 2242–2250.
  42. Tang X., Measurement of the Kinetics of Protein Unfolding in Viscous Sys-tems and Implications for Protein Stability in Freeze-Drying / X. Tang, M.J. Pikal // Phar-maceutical Research. 2005. Vol. 22. Рр.1176–1185.
  43. Нежута А. А. Разработка научно-обоснованных режимов сублимационной сушки биопрепаратов / А. А. Нежута, Е. С. Сербис // Биотехнология. 2001. № 6. С. 59–67.
  44. Могилюк В. Аспекты лиофилизационной сушки водных растворов / В. Могилюк // Фармацевтическая отрасль. 2014. № 5(46). С. 46–53.
  45. Ellab White Paper — 08/18. The Freeze Drying Theory and Process Things to Consider. Cсылка: URL: (дата обращения 27.11.2025).
  46. Grant Y. G. Engineering the rational design and optimisation of freeze-dried pharmaceutical formulations using microtitre plates. PhD Thesis. University College London; 2011.
  47. Trnka H. et al. Well-plate freeze-drying: a high throughput platform for screening of physical properties of freeze-dried formulations // Pharm. Dev. Technol. 2015. 20(1): 65–73.
  48. Tchessalov S., Maglio V., Kazarin P. et al. Practical Advice on Scientific Design of Freeze-Drying Process: 2023 Update // Pharm. Res. 2023. Vol. 40. Pр. 2433–2455.
  49. Huang L. et al. Mannitol–sucrose mixtures: versatile formulations for protein lyophilization // J. Pharm. Sci. 2015. 104(2): 476–485.
  50. Mehmood Y. et al. Excipients use in parenteral and lyophilized formulation development // Int. J. Pharm. Sci. Res. 2011. 2(8): 1886–1901.
  51. Buceta J. P. et al. Heat transfer during freeze-drying using a high-throughput platform // J. Pharm. Sci. 2021. 110(11): 3488– 3499.
  52. Coussot G., Tchessalov S., Jozefowicz M. et al. Freeze-drying of few microliters of antibody formulations to preserve functionality: Low-Volume Lyophilization (LoVLy) process // Anal. Chim. Acta. 2023. Vol. 1258. Pр. 341–352.
  53. Cicerone M. T., Pikal M. J. Thermophysical aspects of low-volume lyophilization: implications for product design and process control // J. Pharm. Sci. 2017. 106(10): 2845– 2856.
  54. Fonseca F., Blel W., Passot S. Freeze-drying cycle design for low-volume systems: challenges and process optimization // Drying Technol. 2019. 37(6): 735–746.
  55. Patel S. M., Pikal M. J. The challenge of freeze-drying small-volume samples: impact of chamber pressure and heat transfer on product temperature // J. Pharm. Sci. 2011. 100(7): 2925–2939.
  56. Pisano R., Arsiccio A., Capozzi L. C. Modeling pressure-control strategies in smallscale freeze-drying: implications for microplate formats // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2020. 154: 1–10.
  57. Pikal M. J., Shah S. The collapse temperature in freeze-drying: dependence on measurement methodology and secondary drying behavior // J. Pharm. Sci. 1990. 79(7): 655–660.
  58. Opalski A. S., Ruszczak A., Promovych Y., Horka M., Derzsi L., Garstecki P. Combinatorial Antimicrobial Susceptibility Testing Enabled by Non-Contact Printing. Micromachines. 2020. 11. 142.
  59. URL: https://aksamedical.com/wp-content/ uploads/2019/12/p180_Kit_Folder.pdf (дата обращения: 27.11.2025).
  60. URL: https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/MBD/Package-Inserts/010_NONTBMYCO_-US-GBCID10796_%28002%29.pdf (дата обращения: 27.11.2025).
  61. URL: https://www.biolog.com/product-literature/anaerobic-bacteria-an-microplate-instructions-for-use/ (дата обращения: 27.11.2025).
  62. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing (CLSI M100). 33rd ed. CLSI; 2023; Andrews J.M. Determination of minimum inhibitory concentrations // J. Antimicrob. Chemother. 2001. 48(S1): 5–16.
  63. Andrews J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations // J. Antimicrob. Chemother. 2001. 48(S1): 5–16
  64. European Medicines Agency, Committee for Medicinal Products for Human Use (2022) ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis. EMA/ CHMP/ICH/172948/2019
  65. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine (2018) Guidance for industry: bioanalytical method validation
  66. Zhou W., Yang S., Wang P.G. LC–MS methods for analysis of antibiotics in pharmaceutical formulations // J. Pharm. Biomed. Anal. 2012. 56(2): 237–246.
  67. Berrada H., Callejón R. M., Durán E. Stability-indicating LC–MS/MS methods for β-lactam antibiotics // J. Chromatogr. B. 2018. 1092: 68–76.
  68. Nagata T., Morinaga Y., Matsuda J. Degradation profiling and stability analysis of macrolide antibiotics by LC–MS // J. Pharm. Sci. 2021. 110(3): 1188–1196.