УДК 579.62:576.08
DOI: 10.36871/vet.zoo.bio.202603108

Авторы

Илья Юрьевич Абашин,
Валентина Сергеевна Рыкова,
Наталия Геннадиевна Козырева,
Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко Российской академии наук, Москва, Россия

Аннотация

Высокая распространенность и экономический ущерб от маститов стрептококковой этиологии крупного рогатого скота обуславливают необходимость разработки точных и воспроизводимых методов диагностики. Метод ПЦР в реальном времени нашел широкое применение при диагностике бактериальных агентов. Его результативность напрямую зависит от использования контрольных образцов. Данная статья посвящена разработке и характеристике рекомбинантных контрольных образцов при детекции трех ключевых возбудителей мастита: Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae и Streptococcus uberis. Специфичные генетические мишени для каждого патогена были амплифицированы и клонированы в векторы pAL2-T и pJET1.2/ blunt с последующей трансформацией в компетентные клетки Escherichia coli Top 10. Скрининг позитивных клонов проводили с помощью ПЦР-ЭФ. Эффективность скрининга составила 80 %. Качество и количество выделенных плазмидных препаратов оценивали спектрофотометрически (NanoDrop). Получены препараты плазмидной ДНК с концентрацией от 17 до 199 нг/мкл, оптические коэффициенты чистоты A260/A280 в диапазоне 1,82–1,96 и A260/A230 – 2,0–2,2. Расчетное число копий варьировало от 4,7×10⁹ до 5,6×10¹⁰ копий/мкл. Валидация методом ПЦР-РВ в тысячекратных разведениях подтвердила наличие целевых вставок во всех образцах (Ct <15) и выявила ожидаемую обратную зависимость между концентрацией ДНК и пороговым циклом. В результате исследования разработан и охарактеризован набор специфичных ПКО, пригодных для использования в качестве стандартов при разработке, валидации и рутинном применении ПЦР-тест-систем для диагностики стрептококковых маститов.

Ключевые слова

молекулярная биология, генная инженерия, стрептококки, КРС, мастит

Список литературы

  1. Абашин И. Ю. Ген sua как диагностическая мишень при детектировании S. uberis у крупного рогатого скота методом ПЦР // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2023. № 7. С. 63–67. DOI: 10.36871/vet.zoo.bio.202307008. EDN IAFRXF.
  2. Абашин И. Ю., Козырева Н. Г. Компьютерное моделирование олигонуклеотидов для выявления Streptococcus dysgalactiae методом полимеразной цепной реакции в реальном времени // Материалы VIII Национального конгресса бактериологов (Москва, 27–28 сентября 2023 г.). М.: Династия, 2023. С. 5–6. EDN FYPHBO.
  3. Абашин И. Ю., Козырева Н. Г. Молекулярно-генетический подход для выявления Streptococcus agalactiae по гену CFB (CAMP-фактор) // Достижения и проблемы ветеринарной медицины на Крайнем Севере Российской Федерации: сборник материалов международной научнопрактической конференции, посвященной 115-летию организации Якутской бактериологической лаборатории и проведения научных исследований по ветеринарной медицине в Якутии (Якутск, 07–08 декабря 2023 г.). Якутск: ООО «Компания «ДаниАлмас», 2024. С. 144–149. EDN KVNLLY.
  4. Гнездилова Л. А., Борунова С. М., Абра‑ мов П. Н. Синтетические среды для разбавления спермопродукции сельскохозяйственных производителей и биологическая роль отдельных компонентов // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2023. № 4. С. 165–173. DOI: 10.36871/vet. zoo.bio.202304018. EDN OPPTUQ.
  5. Гнездилова Л. А., Федотов С. В., Мура‑ дян Ж. Ю. и др. Влияние микотоксинов на репродуктивные и производственные показатели лактирующих коров в условиях интенсивного производства // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2023. № 4. С. 70–79. DOI: 10.36871/vet.zoo. bio.202304007. EDN TWSRQA.
  6. Позябин С. В., Шумаков Н. И., Кача‑ лин М. Д. и др. Метод лапароскопической пункции фолликулов яичников у коров // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2025. Т. 1. № 10. С. 7–15. DOI: 10.36871/ vet.zoo.bio.202510101. EDN TQHBIB.
  7. Bradley A. J. Bovine Mastitis: An Evolving Disease // The Veterinary Journal. 2002. Vol. 164. No. 2. Рр. 116–128.
  8. Bustin S. A. et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments // Clinical Chemistry. 2009. Vol. 55. No. 4. Рр. 611–622.
  9. Davies P. L. et al. Molecular Epidemiology of Streptococcus uberis Clinical Mastitis in Dairy Herds: Strain Heterogeneity and Transmission // J Clin Microbiol. 2016. Vol. 54. No. 1. Рр. 68–74.
  10. Desjardins P., Conklin D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids // J Vis Exp. 2010. No. 45. Р. 2565.
  11. Forootan A. et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR) // Biomolecular Detection and Quantification. 2017. Vol. 12. Рр. 1–6.
  12. Gillespie B. E., Oliver S. P. Simultaneous Detection of Mastitis Pathogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, and Streptococcus agalactiae by Multiplex Real-Time Polymerase Chain Reaction // Journal of Dairy Science. 2005. Vol. 88. No. 10. Рр. 3510–3518.
  13. Halasa T. et al. Economic effects of bovine mastitis and mastitis management: A review // Veterinary Quarterly. 2007. Vol. 29. No. 1. Рр. 18–31.
  14. Katholm J. et al. Quality of bulk tank milk samples from Danish dairy herds based on real-time polymerase chain reaction identification of mastitis pathogens // Journal of Dairy Science. 2012. Vol. 95. No. 10. Рр. 5702–5708.
  15. Keane O. M. et al. Pathogen profile of clinical mastitis in Irish milk‐recording herds reveals a complex aetiology // Veterinary Record. 2013. Vol. 173. No. 1. Рр. 17–17.
  16. Klymus K. E. et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays // Environmental DNA. 2020. Vol. 2. No. 3. Рр. 271–282.
  17. Ruegg P. L. A 100-Year Review: Mastitis detection, management, and prevention // Journal of Dairy Science. 2017. Vol. 100. No. 12. Рр. 10381–10397.
  18. Taponen S. et al. Real-time polymerase chain reaction-based identification of bacteria in milk samples from bovine clinical mastitis with no growth in conventional culturing // Journal of Dairy Science. 2009. Vol. 92. No. 6. Рр. 2610–2617.
  19. Zadoks R. N. et al. Molecular Epidemiology of Mastitis Pathogens of Dairy Cattle and Comparative Relevance to Humans // J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2011. Vol. 16. No. 4. Рр. 357–372.