УДК 577.2:579.66:579.25:604.6
DOI: 10.36871/vet.zoo.bio.202603207

Авторы

Ирина Владимировна Солтынская,
Оксана Ивановна Кочиш,
Екатерина Викторовна Крылова,
Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), Москва, Россия
Александра Никитична Богомазова,
Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), Москва, Россия; Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю. М. Лопухина Федерального Медико-биологического Агентства, Москва, Россия

Аннотация

В целях мониторинга кормовых добавок и лекарственных средств для животных на наличие в них генетически модифицированных микроорганизмов была необходима разработка и валидация доступных и недорогих скрининговых методик выявления ГМ штаммов бактерий. Основным вариантом для разработки был выбран поиск маркерных генов резистентности, входящих в состав экспрессирующих векторов и используемых для селекции рекомбинантных микроорганизмов. Разработанные методики основаны на применении мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления фрагментов генов устойчивости к блеомицину (ble), хлорамфениколу (cat) и аминоглиозидам (aadD) совместно с внутренним контролем. В качестве внутреннего контроля предусмотрено выявление ДНК бактерий рода Bacillus. В отдельной пробирке детектируется экзогенный синтетический внутренний контрольный образец с целью подтверждения наличия в образце ДНК, качество которой приемлемо для получения ПЦР продукта. Валидационные испытания систем на кормовых добавках и ветеринарных препаратах показали соответствие критериям принятия решения, предъявляемым к ПЦР методикам.

Ключевые слова

генетически модифицированные бактерии, ПЦР в режиме реального времени, скрининговые методики, маркерные гены, гены антибиотикорезистентности, бактерии рода Bacillus, валидация ПЦР-методик

Список литературы

  1. Бонарцев А. П., Воинова В. В., Бонарцева Г. А. Полимерный материал (гидрогель) на основе бактериального альгината для размещения пробиотических бактерий и способ его получения. Патент RU 2740086.
  2. Миронов А. С. и др. Способ получения рибофлавина, штамм bacillus subtilis – продуцент рибофлавина (варианты). Патент RU № 2261273.
  3. МУК 4.2.2305-07. Методические указания. Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией». Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 30.11.2007 № 80.
  4. Постановление Правительства РФ от 18.01.2023 № 35 «О порядке государственной регистрации генно-инженерномодифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, включая указанную продукцию, ввозимую на территорию Российской Федерации, и признании утратившими силу некоторых актов и отдельных положений некоторых актов Правительства Российской Федерации».
  5. Синицын А. П. и др. Интеграционный вектор для многокопийной интеграции генов в 18S РНК дрожжей Pichia pastoris. Патент RU № 2752904.
  6. Солтынская И. В. и др. Выбор элементовмишеней для разработки скрининговых методик выявления генетически модифицированных бактерий, используемых при производстве кормовых добавок и лекарственных средств для животных// Материалы Международной научно-практической конференции «Зоогигиена и экология – залог здоровья и благополучия животных», посвященной 100-летию создания кафедры зоогигиены и птицеводства имени А. К. Даниловой / под общ. ред. С. В. Позябина, И. И. Кочиша. 2024. С. 128–134.
  7. Солтынская И. В., Богомазова А. Н., Кочиш О. И. Выбор мишени для внутреннего контроля при разработке скрининговых ПЦР-методик выявления генетически модифицированных бактерий // Мировое и российское птицеводство: динамика и перспективы развития – научные разработки по генетике и селекции сельскохозяйственной птицы, кормлению, инновационным технологиям производства и переработки яиц и мяса, ветеринарии, экономики отрасли: Материалы XXI Международной конференции (Сергиев Посад, 23–25 сентября 2024 г.). С. Посад, 2024. С. 858–861.
  8. Старовойтова С. А., Скроцкая О. И. Пробиотики на основе трансгенных микроорганизмов // Biotechnologia acta. 2013. Т. 6. No. 1. С. 034–045.
  9. Федеральный закон от 05.07.1996 № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности».
  10. Balbás P., Bolívar F. PBR322 and Protein Expression Systems in E. coli //Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols. 2004. Vol. 267. 77 р.
  11. EFSA Panel on Biological Hazards, 2018. Scientific opinion on the update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA. EFSA J. 15, 4664.
  12. Fraiture M. A. et al. Are antimicrobial resistance genes key targets to detect genetically modified microorganisms in fermentation products? // International journal of food microbiology. 2020. Vol. 331. 108749 р.
  13. Fraiture M. A. et al. Detection strategy targeting a chloramphenicol resistance gene from genetically modified bacteria in food and feed products // Food Control. 2020. Vol. 108. 106873 р.
  14. Fraiture M. A. et al. Identification of an unauthorized genetically modified bacteria in food enzyme through whole-genome sequencing // Scientific Reports. 2020. Vol. 10. No. 1. 7094 р.
  15. Fraiture M. A., Papazova N., Roosens N. H. C. DNA walking strategy to identify unauthorized genetically modified bacteria in microbial fermentation products / / International Journal of Food Microbiology. 2021. Vol. 337. 108913 р.
  16. Glassing A. et al. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples // Gut pathogens. 2016. Vol. 8. No. 1. Рр. 1–12.
  17. Horinouchi S., Weisblum B. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance // Journal of bacteriology. 1982. Vol. 150. No. 2. Рр. 815–825.
  18. http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_ primer_stats.html
  19. https://eu.idtdna.com/calc/analyzer
  20. https://eu.idtdna.com/Primerquest/Home/ Index
  21. https://eurofinsgenomics.eu/en/ecom/tools/ oligo-analysis.aspx
  22. https://eurofinsgenomics.eu/en/ecom/tools/ pcr-primer-design
  23. https://webgate.ec.europa.eu/rasff-window/ screen/notification/456390
  24. https://webgate.ec.europa.eu/rasff-window/ screen/search
  25. https://www.uniprot.org/uniprotkb/P70974/ entry
  26. Kobayashi K. et al. Essential Bacillus subtilis genes //Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003. Vol. 100. No. 8. Рр. 4678–4683.
  27. Lensch A. et al. Recombinant DNA in fermentation products is of no regulatory relevance // Food Control. 2022.
  28. Madden T. The BLAST sequence analysis tool // The NCBI Handbook. 2nd ed. National Center for Biotechnology Information (US), 2013.
  29. Munk P. et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance // Nature Communications. 2022. Vol. 13. No. 1. Рр. 1–16.
  30. Mushegian A. R., Koonin E. V. A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1996. Vol. 93. No. 19. Рр. 10268– 10273
  31. Okonechnikov K. et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. 2012. Vol. 28. No. 8. Рр. 1166–1167.
  32. Paracchini V. et al. Molecular characterization of an unauthorized genetically modified Bacillus subtilis production strain identified in a vitamin B2 feed additive // Food chemistry. 2017. Vol. 230. Рр. 681–689.
  33. Salter S. J. et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses // BMC biology. 2014. Vol. 12. No. 1. Рр. 1–12.
  34. Sievers F., Higgins D. G. Clustal omega // Current protocols in bioinformatics. 2014. Vol. 48. No. 1. Рр. 3.13.1–3.13.16.
  35. Tacconelli E. et al. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis // The Lancet infectious diseases. 2018. Vol. 18. No. 3. Рр. 318–327.
  36. WHO, 2018. Critically important antimicrobials for human medicine, 6th revision. URL: https://www.who.int/publications/i/ item/9789241515528
  37. Ye J. et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction // BMC bioinformatics. 2012. Vol. 13. No. 1. 134 р.